Определение глюкозы в сыворотке в крови: глюкозооксидазный и гексокиназный методы

Для определения концентрации исключительно глюкозы в различных жидкостях организма человека используют глюкозооксидазный метод. Преимуществом этого теста является его точность. Диагностика в отличие от экспресс-методов позволяет выявить количество чистой глюкозы, без домеси к ней фруктозы и других сахаров. Принцип этой реакции заключается в окрашивании раствора, которое происходит вследствие взаимодействия окислителей со специфическими красителями. Оценка результатов исследования проводится с помощью метода колориметрии и сравнения со стандартными растворами.

Определение глюкозы глюкозооксидазным методом

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в лабораториях.
Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основанн на реакции окисления глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь в присутствии пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенных продуктов; о концентрации глюкозы сулят по количеству окрашенных продуктов.

Поскольку глюкозооксидазный метод направлен на выявление именно глюкозы, а не всех видов сахаров, его применяют в дифференциальной диагностике следующих заболеваний:

Принцип глюкозооксидазного метода определения глюкозы

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолуидин образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы. Данный метод позволяет определить уровень глюкозы в плазме крови, сыворотке и спинномозговой жидкости.

Нормальное содержание глюкозы в крови, ммоль/л

— в плазме, натщесерце

новорожденные — 1,7 — 4,2
дети от 6 недель до 15 лет — 3,3 — 5,4
взрослые (мужчины, женщины) — 3,9 — 5,6

— в сыворотке крови, натщесерце

новорожденные — 2,6 — 4,2
дети от 6 недель до 2 лет — 3,3 — 5,4
взрослые (мужчины, женщины) — 3,9 — 5,6

О чем говорит повышение/понижение показателя

Гипергликемия (подъем уровня глюкозы в крови) наблюдается при:

нарушении гормональной функции гипофиза, щитовидной железы: тиреотоксикозе, акромегалии, синдроме Кушинга;
недугах поджелудочной железы: диабете, панкреатите, муковисцидозе, опухолевых явлениях, гемохроматозе;
заболеваниях печени, почек;
нарушениях деятельности нервной системы: кровоизлияниях, опухолях, травмах мозга;
отравлениях эфиром, синильной кислотой;
при менингите, эпилепсии;
сердечных недугах: инфаркте миокарда, стенокардии;
дефиците витамина В 1;
сильных ожогах.

Гипогликемия наблюдается у пациентов с:

опухолью панкреатических островков, дефицитом глюкагона;
повреждениями печени, которые вызваны отравлением мышьяком, алкогольными напитками, антигистаминными таблетками, фосфорными, ртутными соединениями, бензолом, парацетамолом;
недугами печени, когда нарушены гликогенообразование, глюконеогенез;
эндокринными нарушениями: аддисоновой болезнью, гипотиреозом;
болезнями почек, кишечника, обусловленными нарушением всасывания.

Иногда резко падает уровень глюкозы при большой кровопотере, нарушениях рациона питания, голодании, передозировке инсулином, противодиабетическими препаратами.

Необходимые реактивы для определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить несколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

Примечания

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотонический раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфата цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно ежедневно обрабатывать холостую пробу и 2-3 точки в диапазоне 3-9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.

Определение глюкозы глюкозооксидазным методом was last modified: Октябрь 18th, 2020 by Мария Салецкая

Ход определения глюкозы глюкозооксидазным методом

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 минут центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают.

Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13-15 минут, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия.

При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет уровня глюкозы можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой — величину экстинкции.

Примечания к методика определения глюкозы глюкозооксидазным методом

Фармацевтика и Клиническая Диагностика

УТВЕРЖДАЮ

Начальник Управления государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники Минздрава России.

Р.У. ХАБРИЕВ

15 мая 1998г.

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для фотометрического определения содержания глюкозы в сыворотке или плазме крови ферментативным методом

ГЛЮКОЗА — ФКД

Рекомендована к утверждению экспертной комиссией по лабораторным реагентам Комитета по новой медицинской технике Минздрава России (Протокол №7 от 27 октября 1997г.)

НАЗНАЧЕНИЕ.

Набор предназначен для количественного определения содержания глюкозы в сыворотке или плазме крови человека глюкозооксидазным методом в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и в научно-исследовательской практике.

Набор рассчитан на 50 определений при расходе 2,0 мл раствора ферментно-хромогенной смеси на один анализ.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

При окислении b-D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозо-оксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты в присутствии фенольных соединений с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемой пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500 (490-540) нм.

СОСТАВ НАБОРА:

— Ферментно-хромогенная смесь, таблетированная, содержащая калий-фосфатный буфер, фенол-содержащие хромогены, 4-аминоантипирин, стабилизаторы, глюкозооксидазу (1500 ЕД) и пероксидазу (1100 ЕД) — 1 таблетка;

— калибратор (калибровочный раствор глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л) — 1 флакон ;

— антикоагулянт (0,1 моль/л натрия цитрата) — 1 таблетка.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА.

Отклонение от линейности в диапазоне концентраций глюкозы от 2 до 20 ммоль/л не превышает 5%. Чувствительность — не более 1 ммоль/л. Коэффициент вариации — не более 5%.

Для проверки правильности определений рекомендуется использовать отечественные или зарубежные контрольные сыворотки, аттестованные данным методом. Содержание глюкозы в сыворотке или плазме крови человека в норме составляет 4,2-6,1 ммоль/л.

Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить значения нормы для исследуемого контингента людей.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.

Ферментно-хромогенная смесь содержит токсичные компоненты. При работе с ней следует соблюдать осторожность и не допускать попадания на кожу и слизистые. В случае попадания ферментно-хромогенной смеси следует промыть пораженное место большим количеством проточной воды.

При работе следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

Меры предосторожности — соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР», Москва, 1981г.

Химическая посуда и оборудование, которые используются при работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с набором.

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ.

Негемолизированная сыворотка или плазма крови человека.

Сыворотку крови получают обычным способом.

Плазму крови получают следующим образом. Таблетку антикоагулянта внести в 50 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать до полного растворения; полученный раствор можно хранить при температуре +2-8°С не более 7 дней. В центрифужную пробирку внести 0,1 мл крови, добавить 0,9 мл раствора антикоагулянта, тщательно перемешать и центрифугировать при 3000 g в течение 15 минут при комнатной температуре (+18-25°С). Полученную надосадочную жидкость перенести в чистую пробирку и использовать для анализа.

Содержание билирубина до 324 мкмоль/л не влияет на правильность определения содержания глюкозы.

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ:

— Спектрофотометр или фотоэлектрокалориметр, длина волны 500 (490-540) нм, кювета с длиной оптического пути 5 или 10 мм, а также автоматический или полуавтоматический биохимический анализатор;

— термостат водяной, поддерживающий температуру +37 ±1°С;

— пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,025; 0,1; 0,25; 0,9 и 2,0 мл;

— секундомер или таймер (часы);

— колба мерная вместимостью 100 мл;

— пробирки стеклянные вместимостью 10 мл;

— вода дистиллированная.

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ.

Приготовление раствора ферментно-хромогенной смеси.

Таблетку ферментно-хромогенной смеси внести в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавить 70 мл дистиллированной воды, тщательно перемешать до полного растворения таблетки и довести дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ферментно-хромогенной смеси можно хранить при температуре +2-8°С в посуде из темного стекла не более 3 дней при условии достаточной герметизации флакона.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА.

Определение содержания глюкозы в сыворотке крови.

Внести в пробирки анализируемые образцы сыворотки крови и реагенты по следующей схеме:

Реагенты, сыворотка крови	Опытная проба, мл	Калибровочная проба, мл	Холостая проба, мл
Раствор ферментно-хромогенной смеси	2,0	2,0	2,0
Сыворотка крови	0,025	—	—
Калибратор	—	0,025	—
Вода дистиллированная	—	—	0,025

ПРИМЕЧАНИЕ: при использовании автоматических или полуавтоматических биохимических анализаторов количество реагентов и анализируемых образцов в зависимости от объема используемой кюветы может быть пропорционально изменено (отношение сыворотки к раствору ферментно-хромогенной смеси составляет 1 : 80).

Пробы тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 минут при температуре +37°С или в течение 25 минут при комнатной температуре (+18-25°С).

Через 5-10 минут после начала инкубации пробирки с пробами интенсивно встряхнуть вручную.

После окончания инкубации измерить величину оптической плотности опытной и калибровочной проб против холостой пробы в кюветах с длиной оптического пути 5 или 10 мм при длине волны 500 (490-540) нм.

Окраска проб стабильна в течение 2 часов после окончания инкубации при условии предохранения от прямого воздействия солнечных лучей.

РАСЧЕТЫ

Расчет концентрации глюкозы в анализируемых пробах провести по формуле:

ЕО

С = ¾¾ * 10 ,

ЕК

где: С — концентрация глюкозы, ммоль/л; ЕО -оптическая плотность опытной пробы, ед. опт. плотн.; ЕК — оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт. плотн.; 10 — концентрация глюкозы в калибраторе, ммоль/л.

Определение содержания глюкозы в плазме крови.

В пробирки внести 2,0 мл раствора ферментно-хромогенной смеси, добавить по 0,25 мл надосадочной жидкости, полученной так, как это описано в разделе «Анализируемые образцы».

Калибровочный раствор готовить следующим образом: в пробирку внести 0,025 мл калибратора (1 часть) и 0,225 мл раствора антикоагулянта (9 частей) и тщательно перемешать (приготовление раствора антикоагулянта см. Раздел «Анализируемые образцы»), полученную смесь можно хранить при температуре +2-8°С не более 1 дня; для определения взять 0,25 мл полученной смеси..

Далее определение содержания глюкозы и расчеты проводить как это описано в разделе «Определение содержания глюкозы в сыворотке крови»).

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ.

Хранение набора должно проводиться при температуре +2-8°С в темном месте в течение всего срока годности (1 год).

Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 10 дней.

Замораживание не допускается.

Раствор ферментно-хромогенной смеси можно хранить при температуре +2-8°С в посуде из темного стекла не более 3 дней при условии достаточной герметизации флакона.

Калибратор после вскрытия флакона можно хранить при температуре +2-8°С в темном месте не более 3 месяцев.

Раствор антикоагулянта можно хранить при температуре +2-8°С не более 7 дней.

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.

Глюкозооксидазный способ определения глюкозы

Когда назначается проведение глюкозооксидазного метода?

Этот тест используют для выявления нарушения толерантности к сахару и развития преддиабета, а также в стадии разгара болезни. Но для таких целей анализ используют редко, это связано с его высокой стоимостью и длительным ожиданием результата. Чаще всего определение глюкозы в крови и моче с помощью этого метода применяют при дифференциальной диагностике таких заболеваний, как:

синдром непереносимости лактозы;
непереносимость фруктозы;
выделение фруктозы с биологическими жидкостями организма;
повышенная концентрация пентозы в моче.

Несомненным достоинством глюкозооксидазного теста является его точность.

Задания для контроля сформированности компетенций в учебное время:

Какие функции в организме выполняют углеводы?
Какова структура крахмала?
Какие типы связей встречаются в молекуле гликогена?
Дайте определение понятиям: гомополисахариды, гетерополисахариды.
В каком отделе пищеварительного тракта, и под действием каких ферментов происходит переваривание углеводов?
Какие углеводы стимулируют перистальтику желудочно-кишечного тракта?
С недостатком, какого фермента связана непереносимость молока?
Почему дисбактериозы сопровождаются диареей?
В чем сущность анаэробного окисления углеводов? Напишите словами схему анаэробного окисления углеводов.
В чем сущность аэробного окисления углеводов? Дайте характеристику этапов аэробного окисления углеводов и его энергетическую ценность.
Назовите источники, поддерживающие уровень глюкозы в крови.

12. Почему процессы гликолиза и глюконеогенеза не могут идти с одинаковой

скоростью?

13. Какой тип окисления глюкозы характерен для мышц в состоянии покоя?

14. Какой тип окисления глюкозы характерен для мозга?

15. Какую информацию может дать определение уровня лактата в крови?

Регуляция уровня глюкозы в крови.
Источники глюкозы крови.
Почечный порог для глюкозы, глюкозурия.
Толерантность к глюкозе.

Что в основе этого способа?

Существуют различные методы определения концентрации глюкозы в крови, но глюкозооксидазный является наиболее точным. Подоснова его состоит в том, что при взаимодействии сахара с кислородом воздуха происходит окисление реагента. В раствор выделяется перекись водорода. Это вещество взаимодействует с ортотолуидином, образуя окрашенное соединение. Для поведения этой реакции необходимо присутствие специальных ферментов. При реакции окисления должна присутствовать глюкозооксидаза, а при окрашивании жидкости — пероксидаза. Интенсивность окраски раствора будет зависеть от содержания глюкозы и быть более всего интенсивной при высоком ее содержании.

Глюкоза крови в клинической практике

Более 90 % всех растворимых низкомолекулярных углеводов крови приходится на глюкозу; кроме того, в небольших количествах могут присутствовать фруктоза, мальтоза, манноза и пентозы, а при патологии и галактоза. Наряду с ними в крови содержатся связанные с белками полисахариды.

Особенно интенсивно глюкозу потребляют и используют для разнообразных нужд ткани центральной нервной системы, эритроциты, мозговое вещество почек. В промежуточном обмене глюкоза используется для образования гликогена, глицерина и жирных кислот, аминокислот, глюкуроновой кислоты и гликопротеинов. Концентрация глюкозы в крови является производной процессов гликолиза и окисления трикарбоновых кислот в ЦТК, гликогенеза и гликогенолиза в печени и мышечной ткани, глюконеогенеза в печени и почках, поступления глюкозы из кишечника.

В клинической практике обычно исследуют содержание глюкозы в крови, к определению концентрации других сахаров и гликогена прибегают значительно реже. В крови человека глюкоза довольно равномерно распределена между плазмой и форменными элементами, установлено, что в венозной крови содержание сахара на 0,25‑1,0 ммоль/л (в среднем на 10 %) меньше, чем в артериальной и капиллярной. Известную диагностическую ценность представляет определение молочной и пировиноградной кислот, активности ряда ферментов углеводного обмена, сиаловых и гексуроновых кислот, серомукоидов, гликозилированного гемоглобина и других показателей.

Содержание глюкозы в моче зависит от ее концентрации в крови, хотя выделяется она как при нормальном, так и при повышенном уровне сахара крови. При повышении концентрации глюкозы в крови преодолевается так называемый почечный порог (у здоровых людей лежит в области 8,3‑9,9 ммоль/л) и наступает глюкозурия. При артериосклеротической почке, при диабете порог повышается и может не отмечаться глюкозурия даже при повышении концентрации глюкозы до 11,0‑12,1 ммоль/л.

Как проводится анализ?

Забор материала от больного осуществляется натощак. Для проведения теста используют венозную кровь в количестве 5 мл. Накануне диагностики больному показана строгая диета. Это позволит судить о достоверности результата и исключить возможные погрешности анализа. За 2 дня перед изъятием крови пациент должен отказаться от вредных привычек употребления алкоголя и курения. Также необходимо ограничить прием чрезмерно сладких блюд и по возможности избегать стрессовых ситуаций.

Чаще всего этот метод определения концентрации глюкозы выполняют способом центрифугирования, которым выделяют форменные элементы. Количество сахара определяют уже в плазме. При добавлении к ней всех необходимых реагентов окраска наблюдается через 20 минут, если тест проводится при комнатной температуре. Расчет уровня глюкозы проводится по калибровочному графику или с помощью правила порций.

Реактивы для исследования

Для определения сахара наиболее удобно использовать экспресс-методы определения глюкозы в крови. Это объясняется простотой в использовании и быстрым получением результата. Кроме этого, больному не нужно идти в лабораторию или больницу. Но в отличие от глюкозооксидазного теста такая диагностика является недостоверной. Так как не дифференцирует глюкозу от других сахаров и определяет их концентрацию вместе.

Основу глюкозооксидазной реакции составляет натрия хлорид 9% раствор и цинка сульфат 50%. Их добавляют на стадии центрифугирования крови. Кроме этого, используют буферный раствор с уксусной кислотой и ацетатом натрия. Методом титрования определяют его рН на уровне 4,8. После, добавляется глюкозооксидаза, из-за чего выделяется перекись водорода и пероксидаза, участвующая в окрашивании раствора до нужной концентрации для получения точного результата.

Клинико‑диагностическое значение

Кровь

Гипергликемические состояния

Гипергликемическим является состояние, при котором концентрация глюкозы в крови более 6 ммоль/л. По происхождению выделяют две группы таких состояний:

Физиологические

алиментарные — связаны с приемом пищи и продолжаются в норме не более 2 часов после еды;
нейрогенные — нервное напряжение, стимулирующее секрецию адреналина и мобилизацию гликогена в печени;
гипергликемия беременных — связана с относительной недостаточностью инсулина при увеличении массы тела и потребностью плода в глюкозе.

Патологические

при заболеваниях гипофиза, коры и мозгового слоя надпочечников, щитовидной железы, связанных с избытком гликемических гормонов;
раздражении ЦНС: кровоизлияния в мозг, травмы, опухоли, отравления окисью углерода, эфиром, синильной кислотой и т. п., менингит, эпилепсия;
заболеваниях поджелудочной железы: сахарный диабет (взрослый и юношеский), диабет беременных, острый и хронический панкреатиты, муковисцидоз, опухоли, гемохроматоз. Выраженная гипергликемия без кетоза встречаются у больных сахарным диабетом средней тяжести (или у лиц не страдающих им, с высоким уровнем эндогенного инсулина, предотвращающего развитие кетоза). Содержание глюкозы в крови может превышать 50 ммоль/л, в отличие от диабетического кетоацидоза, при котором уровень глюкозы вкрови часто ниже 33 ммоль/л;
при хронических заболеваниях печени и почек;
остром инфаркте миокарда, тяжелой стенокардии, авитаминозе В1, при ожогах (первые сутки).

Гипогликемические состояния

Гипогликемическим является состояние, при котором концентрация глюкозы в крови ниже 3,5 ммоль/л. Причины гипогликемий:

Физиологические

краткое или долгосрочное голодание.

Патологические

гиперинсулинизм в результате передозировки или инсулиномы (инсулинпродуцирующая опухоль) или избыточной активности инсулиназы (синдром Мак-Куорри);
гликогенозы;
недостаток гликемических гормонов при гипопитуитаризме, аддисоновой болезни;
у недоношенных и новорожденных — охлаждение, малые запасы гликогена в печени и ее общая незрелость;
тяжелых повреждениях печени: отравления мышьяком, хлороформом, алкоголем, салицилатами, антигистаминными препаратами, фосфором, тетрахлоридом углерода, бензолом, парацетамолом и т. п.;
заболеваниях печени, сопровождающихся нарушением гликогенообразования и глюконеогенеза;
нарушения кишечника, гельминтозы, дисбактериозы.
заболеваниях почек с нарушением реабсорбции.

Моча

Выведение глюкозы возрастает при всех случаях гипергликемии свыше 10 ммоль/л (почечного порога). В этом случае глюкозурии могут быть физиологическими и патологическими:

к физиологическим относятся алиментарная глюкозурия, глюкозурия беременных и нейрогенная глюкозурия на почве стрессовых состояний,
патологическая глюкозурия обнаруживается при сахарном диабете, тиреотоксикозе, акромегалии, гиперплазии коры надпочечников, инфаркте миокарда, кровоизлияниях во внутренние органы, отравлениях морфином, фосфором, при острых инфекциях и нервных заболеваниях.

При нормогликемии глюкозурия может выявляться при повреждениях почечных канальцев — пиело- и гломерулонефриты, токсические поражения, почечный диабет (семейная почечная глюкозурия), нефропатии.

Снижение глюкозы в моче (вплоть до исчезновения) является признаком бактериурии.

Спинномозговая жидкость

Уровень глюкозы повышен при сахарном диабете, эпидемическом энцефалите, сифилисе ЦНС, гипергликемиях различной этиологии.

Уменьшение концентрации глюкозы определяется при остром пиогенном менингите, туберкулезном и криптококковом менингите, менингоэнцефалите, опухолях мягкой мозговой оболочки, саркоидозе.

Нормы при проведении анализа

Измерение количества сахара происходит в специальных единицах — миллимолях на литр раствора.

Глюкозооксидазное исследование крови проходят обязательно на пустой желудок и используют для этого плазму или сыворотку. Норма количества ее для взрослых как для женщин, так и для мужчин составляет 3,3—5,5. Для детей до 15-ти лет этот показатель немного ниже и колеблется в пределах 3,2—5,3. У новорожденных глюкоза крови составляет 1,7—4,2. Увеличение показателей наблюдается при развитии у больного сахарного диабета или при нарушении толерантности к глюкозе. Это состояние является преддиабетом, и если его вовремя не лечить, то в скором времени оно приведет к развитию этой тяжелой патологии.

источник

Подготовка к анализу

Исследования сыворотки крови на глюкозу назначают при:

обеих формах диабета для диагностики, мониторинга заболевания;
нарушениях в работе щитовидной железы, гипофиза;
лишнем весе;
нарушении толерантности к глюкозе.

Перед анализами нужно соблюдать ряд условий, чтобы результаты были максимально достоверными:

исследование проводится натощак. Материал берут в утреннее время;
за пару дней до диагностики нужно избегать тяжелой физической нагрузки, стресса;
в суточном рационе пациента должно присутствовать не менее 150 грамм углеводов. При недостатке будет расти уровень глюкозы, а падает он медленно, что искажает данные анализа;
за сутки до диагностики нельзя курить и пить алкогольные напитки;
нельзя проводить исследование после тяжелых операций, родов, при наличии воспалений. Противопоказан анализ при циррозе печени, обострении болезней желудка, опухолевых процессах;
за пару дней до исследования не следует проходить физиотерапевтические процедуры, принимать оральные контрацептивы, мочегонные препараты, психотропные средства, кофеин.

Состояние натощак определяется как промежуток между приемами пищи не менее восьми часов. Забор крови осуществляют после ночного воздержания от еды.

Анализ может дать ложный положительный результат при гипокалемии и эндокринных болезнях (синдроме Кушинга, тиреотоксикозе).

Современные методы определения глюкозы

Герасименко В.А., к.м.н., Куриляк О.А., к.б.н.

Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.

Влияющие факторы

Завышенные результаты уровня глюкозы в крови наблюдаются после приема пищи, при применении кофеина, препаратов гормонов надпочечников, тироксина, пероральных контрацептивов, витамина РР (в больших дозах), диуретиков, при физических упражнениях, эмоциональном возбуждении и других стрессовых воздействиях. Влияние in vitro оказывают галактоза и другие моносахара сыворотки крови, аскорбиновая кислота, леводопа, метилдофа, парааминосалициловая кислота и другие.

Снижение концентрации отмечается после применения анаболических стероидов, антигистаминных препаратов, токсичных доз ацетилсалициловой кислоты, этанола. На результаты анализа влияет наличие гемолиза (выход глутатиона из эритроцитов), высокое содержание аскорбиновой и ацетилсалициловой кислоты в крови.

Методы определения глюкозы в сыворотке крови

— фотометрический по конечной точке

— отражательная фотометрия – сухая химия

Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.

Глюкозооксидазный метод

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О2 — , который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Рисунок 1. Спектр рабочего раствора Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

Рисунок 3. Измерительная ячейка

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.

Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».

Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.